У Вас есть удачное изобретение?

Публикуйте концепцию и возможно инвестор заметит Вас!

ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ

МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

11-11-2015

ВВЕДЕНИЕ В КВАНТОВУЮ ФОНОННУЮ БИОЛОГИЮ МЕМБРАН.

Биологические мембраны являются одной из важнейших клеточных структур. Не смотря на многообразие выполняемых операций, мембраны характеризуются общими структурными и функциональными чертами. В настоящее время существует ряд различных моделей строения и функционирования биомембран. Все они базируются на ставшей уже классической Мозаичной структуре биомембран. В данной серии работ предложена ещё одна – “Молекулярно-механическая модель строения и функционирования биологических мембран”.

Основное достоинство предложенной “Молекулярно-механическая модели строения и функционирования биологических мембран” (в дальнейшем – Модели) заключается в том, что она позволяет описывать широкий спектр различных явлений. Всё это удалось сделать без привлечения каких-либо специфических допущений, а только в рамках современной молекулярной физики не только качественно, но и количественно.

В рамках Модели естественно описывается влияние липидов на структуру и функционирование проникающих мембранных белков, нарушение структуры и функционирования биомембран под действием посторонних агентов и т.д. В частности, становится ясной необходимость “жидкой” липидной фазы, роль липида в передаче межмолекулярной и трансмембранной информации и путей разделения её потоков, механизм автоматического демпфирования внешних и внутри мембранных воздействий и возмущений.

В настоящее время нельзя утверждать, что предложенная Модель является полностью законченной и универсальной, что она применима во всех случаях. Естественно, что по мере накопления новых экспериментальных фактов, в неё могут вноситься дополнения и уточнения. Особенно это касается “неклассических” разделов Модели.

Кроме того, специальных исследований требует определение возможности применения Модели для вирусов, содержащих липидные оболочки (суперкапсиды) и, быть может, для иных липосодержащих вирусов. К ним относятся многие ДНК-содержащие вирусы, например, вирусов группы оспы (variola) и гепреса (herpes), а также, практически, все крупные РНК-содержащие вирусы, за исключением реовирусов. Хотя достаточно высокое содержание липидов, около 25 % от веса сухого вируса, сравнимое с содержанием липидов в плазматической мембране клеток, позволяет надеяться на успешное решение данного вопроса.

Кратко можно сказать, что биомембрана это не только граница разных сред, т.е. каждый монослой является только частичной границей. А сама Биомембрана – граница, разделяющая живое и неживое. По одну её сторону живая клетка, по – другую – неживая природа, т.е., биомембрана расположена где-то между живым и неживым.

В представленных работах кратко изложены основные понятия и физические параметры, используемые при описании Модели. (В работах приведены только те собственные экспериментальные данные, которые иллюстрируют использование упомянутых выше параметров биомембран, и которые не публиковались ранее.) Эти понятия необходимы для понимания полученных выводов, позволяющих описывать свойства мембран различных клеток, находящихся в разных фазах своего жизненного цикла. Полученные в рамках Модели, выводы и их экспериментальная проверка были использованы в серии изобретений, находящихся сейчас в процессе патентования (РСТ/CZ01/00046 от 26.08.2001). В представленной заявке предложены методы идентификации и/или селективного воздействия на выбранные клетки в различных клеточных системах. Эти методы позволяют не только идентифицировать отдельные виды клеток в различных клеточных системах, но и определять фазы клеточного жизненного цикла. Затем, при необходимости, селективно воздействовать на выбранные клетки бесконтактными методами.

Теор. обоснование Авторского свидетельства SU 1465768 A1 “СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ДАВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН”, 23.06.86, С.Н. Семёнов и Н.И. Королёв.

С.Н. Семёнов

Проведенное ранее изучение ряда соединений на границе раздела фаз показало, что движущей силой, вызывающей конформационные и агрегационные перестройки в пептидных цепях является латеральное давление в монослое (1 – 5, след. статьи данной серии). Иными словами, изменения конформации и/или агрегации полипептидов обусловлено механическим давлением, действующим на молекулу со стороны окружающего её монослоя.

Из термодинамики следует (6, 7), что при нанесении поверхностно-активного вещества на границу раздела фаз, её свободная энергия понижается. Измеряемая в опыте величина поверхностного давления (ΔР) представляет собой уменьшение свободной энергии (ΔF) единицы площади поверхности.

Таким образом:

ΔР = γ – γ’ = -ΔF

где γ – поверхностное натяжение чистого раствора;

γ’ – поверхностное натяжение раствора с монослоем на его поверхности.

Известно, что состояние равновесия незамкнутой системы при постоянной температуре и объёме (площади) отвечает минимум свободной энергии. Поверхность раздела фаз представляет пример такой системы, поэтому более поверхностно-активное вещество вытесняет с границы раздела фаз вода-воздух менее поверхностно-активное вещество. В системе, содержащей несколько невзаимодействующих поверхностно-активных компонент, максимальное поверхностное давление не может превышать величины равновесного поверхностного давления (поверхностного давления коллапса монослоя) наиболее поверхностно-активного соединения. (Эффект полислойной адсорбции на границе раздела фаз не учитывается, хотя и может приводить к небольшому увеличению давления.) Невыполнение данного условия указывает на взаимодействие частиц либо в монослое, либо в монослое и подстилающем растворе, как это наблюдалось при адсорбции исследованных пептидов на фосфолипидных монослоях. Этим и было обусловлено введение понятие пептид-липидного комплекса.

Образовавшиеся пептид-липидные комплексы можно рассматривать как новый неионный поверхностно-активный компонент монослоя. Экспериментальные данные указывают, что внедрение комплексов в монослой сопровождается увеличением его поверхностного давления до величин, не превышающих давления коллапсов соответствующих пептид-липидных комплексов. Следовательно, пептид-липидные комплексы и окружающие их липидные молекулы можно рассматривать как невзаимодействующие между собой частицы, т.е. энергия любых других взаимодействий между компонентами монослоя, за исключением взаимодействия с подстилающим раствором и теплового движения на поверхности, обуславливающих наличие поверхностного давления в монослое, равна 0. Корректнее говорить, что все другие взаимодействия между частицами в монослое малы по сравнению с kT, где k - константа Больцмана, Т – абсолютная температура в градусах Кельвина.

Для смешанного монослоя, состоящего из фосфолипида и пептид-липидных комплексов, можно написать следующую систему уравнений:

Sп – Sк`Nк = Sл(`Nл - λ`Nк)

Sп – Sк``Nк = Sл(``Nл – λ``Nк)

где: Sп - площадь поверхности раздела фаз вода-воздух;

Nл - первоначальное количество молекул липида на поверхности;

Sл – площадь, занимаемая одной молекулой липида на поверхности;

Nк – количество полипептидных молекул, внесённых в раствор;

Sк - площадь, занимаемая одним пептид-липидным комплексом на поверхности;

λ - коэффициент, показывающий, сколько липидных молекул приходится на одну полипептидную молекулу в комплексе.

Для решения системы уравнений Nл и Nк берутся из разных кривых титрования при одинаковом поверхностном давлении. Для грамицидина S, когда λ = 2, найденные из уравнений площади, приходящиеся на молекулу фосфатидной кислоты в монослое, совпадают со значениями, полученными при сжатии монослоёв чистого фосфолипида. Среднее квадратичное отклонение между полученными при решении, приведённой выше системы уравнений, и экспериментально измеренными значениями площадей не превышали 6 Ǻ2, т.е. лежали в пределах ошибки опыта. Совпадение площадей также подтверждает сделанный выше вывод, что на границе раздела фаз можно рассматривать фосфолипид и комплексы как невзаимодействующие между собой частицы. В противном случае, если бы между частицами в монослое было притяжение или отталкивание (любое специфическое взаимодействие, не зависимо от его физической природы), то эффективная (кажущаяся) площадь, приходящаяся на молекулу вещества, была, соответственно, либо больше, либо меньше той, которая измерена для чистого соединения. Система уравнений была использована, как ещё один независимый способ, показать, что пептид-липидные комплексы и фосфолипид можно рассматривать в виде невзаимодействующих между собой молекул (невзаимодействующие в том смысле, как это было определено выше).

Прямое измерение свободной энергии при взаимодействии катионных полипептидов с фосфолипидными монослоями и приведённые выше решения системы уравнений однозначно указывают, что многократные попытки объяснить деструктурирующее влияние этих соединений на мембраны, с помощью липид-белковых гидрофобных взаимодействий не имеют под собой реальной почвы. Тем более что, по сути, гидрофобные взаимодействия это некий процесс, уменьшающий энтропийный член свободной энергии системы. Это происходит при взаимодействии ряда молекул (называемых гидрофобными) с водным окружением, что, вообще говоря, полностью соответствует их названию. (Наличие у молекул “нелюбви” к чему-либо ещё абсолютно не означает их “сильной любви” к чему-то другому.)

Гидрофобные взаимодействия обуславливают само ассоциацию молекул, их стремление избежать контакта с водой, что приводит к их выходу на границу раздела полярной и неполярной фаз, в том числе и встраивание в мембраны. Иначе говоря, эти взаимодействия ответственны за поверхностную активность молекул, их способность переходить из одной фазы в другую, включая и их границу.

Нужно отметить, что понятие “гидрофобный/гидрофильный” имеет смысл только для достаточно больших систем, когда уже вступают в силу статистические закономерности, и теряют смысл при рассмотрении отдельных молекул. Корректнее, это энтропийный вклад в свободную энергию системы, указывающий на вероятность существования того или иного состояния в огромной системе.

Связь поверхностной активности пептид-липидных комплексов с их деструктурирующим действием на мембраны.

Существует несколько полуэмпирических теорий взаимодействия липидных молекул в бислоях, основы которых были заложены ранее (8 – 10). Полученные результаты говорят, что наличие невзаимодействующих с липидом молекул должно уменьшать прочность мембран (11 – 13) за счёт образования структурных дефектов. Поэтому разумно предположить, что достижение некоторой поверхностной плотности дефектов (N) в бислойной части мембраны приводит к разрушению последней. Выше показано, что пептид-липидные комплексы не взаимодействуют в мембране с окружавшим фосфолипидом и, следовательно, их можно рассматривать как зародыши дефектов в структуре липидного бислоя.

Пептид-липидные комплексы названы зародышами дефектов потому, что возмущения, вызываемые внедрением чужеродных (не липидных) молекул, захватывают обычно не только ближайших соседей (14).

Оценим вероятность образования таких дефектов мембране, рассматривая образование и/или внедрение пептид-липидных комплексов в бислойные участки биомембран, как возникновение дефектов её структуры.

Очевидно, что вероятность образования N дефектов в мембране пропорциональна образованию одного дефекта для невзаимодействующих (независимых) дефектов.

Пусть F(P,T) – свободная энергия единицы поверхности липидного бислоя биомембраны;

Еп – поверхностная энергия пептид-липдного комплекса.

Тогда вероятность W(Еп) образования дефектов в мембране будет равна вероятности образования, за счёт флуктуаций плотности упаковки липидных молекул (15), участков в мембране с энергией, не превышающей Еп. Таким образом, искомая вероятность пропорциональна:

W(Еп) ~ exp [F(P,T) – Еп] / kT (1)

С учётом того, что:

Fп = Еп – ТSп (2)

где: Fп - свободная поверхностная энергия комплексов;

Sп – поверхностная энтропия комплексов.

Формулу 1 можно переписать в следующем виде:

W(Еп) ~ exp[F(P,T) – Fп – ТSп]/kТ (3)

Очевидно, что для невзаимодействующих, хаотически распределённых дефектов, образованных пептид-липидными комплексами, ехр –(ТSп/kТ) представляет собой постоянный сомножитель и его можно опустить. (Постоянный сомножитель на пропорциональность не влияет.) Тогда формулу 3 можно переписать в виде:

W(Eп) ~ ехр [F(P,T)/kT] exp-(Fп/kТ) (4)

Обе стороны уравнения 4 умножим на 1, но для левой части уравнения 1 представим в виде: 1 = ехр(Fв – Fв)/kТ, где Fв – свободная энергия границы раздела фаз вода/воздух. Тогда, с учётом самого первого уравнения, приведённого в начале работы, для связи свободной энергии и поверхностного давления получим:

W(Еп) ~ ехр(ΔРк/kT) exp(ΔРм/kТ) (5)

где ΔРм – поверхностное давление мембраны;

ΔРк - поверхностное давление пептид-липидного комплекса.

При выводе формулы подразумевалось, что поверхностное давление мембраны больше поверхностного давления образования и равновесного существования на границе раздела фаз дефектообразующих частиц. Иначе, все частицы могут образовать структурные дефекты в такой мембране. Вопрос в том, что произойдёт быстрее - или мембрана разрушится, если частиц много и для нарушения нормального функционирования системы достаточно части из них, или они все встроятся в мембрану, но их число будет меньше некоторого порогового, критического значения и их влияние можно будет и не заметить.

Таким образом, получено, что при действии различных соединений на одну и туже мембрану, их эффективность экспоненциально возрастает с ростом их поверхностной активности. А при действии одного вещества на разные мембраны – экспоненциально падает при росте поверхностного давления мембраны, т.е. резко зависит от плотности упаковки липидных, да и не только липидных молекул.

Пептид-липидные комплексы грамицидина S и его аналогов с фосфолипидами обладали разными значениями предельного поверхностного давления (2) на границе раздела фаз и разной биологической активностью. Образуемые ими липидные комплексы, как показано выше, обладали свойствами, присущими дефектообразующим частицам на границе мембрана/омывающий раствор. Следовательно, при действии на биологические мембраны, поверхностное давление которых близко к давлению коллапса комплексов грамицидина S с фосфолипидом, лизирующая способность природного антибиотика должна быть в, примерно, 44 раза выше, чем у его “полностью L” аналога т.к. ехр (34,0/9,0) = 43,7. Такому условию удовлетворяют мембраны эритроцитов человека, поверхностное давление которых лежит в пределах 31 – 35 дин/см (16). Поэтому, отношение гемолитических активностей указанных соединений или, что то же самое, скорость лизиса эритроцитов, должна быть близка к теоретически ожидаемой величине. Экспериментальная проверка этого предположения была проведена в ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР. Получено, что скорость гемолиза эритроцитов человека (а именно автора) в физиологическом растворе в присутствии грамицидина S в 44 раза выше, чем в присутствии его ретро- или “полностью L” аналогов. Поверхностные давления и площади комплексов этих соединение с фосфолипидом были практически равны.

Очевидно, что получено не просто хорошее совпадение, а очень хорошее совпадение теоретических и экспериментальных значений отношения биологических активностей мембрано-активных соединений. Это говорит, что начальные предположения и последующие выводы являются справедливыми.

Не сложно получить и остальные формулы, приведённые в авторском свидетельстве для определения поверхностного давления биологических мембран, основанные на сравнении биологических активностей грамицидина S и его “полностью L” аналога. (Ретро-грамицидин S для этих целей мене пригоден, т.к. коллапс его комплексов с фосфолипидом менее ярко выражен, чем его “полностью L” аналог.)

{Данный вывод легко распространить и на другие классы мембрано-активных соединений, биологическая активность которых контролируется процессом их проникновения в углеводородную – гидрофобную – область различных мембран, например, тех же фосфолипаз. Если можно наблюдать биологический эффект при малых воздействиях (малых концентрациях) активных молекул, то их взаимовлиянием, скорее всего, можно пренебрегать. Кстати, для поверхностно активных соединений, это может быть и обратным тестом – типа, определения лимитирующей стадии реакции.)

Так как силы сцепления (скорее энергия образования/взаимодействия?) между липидными молекулами зависят от расстояния между ними и пропорциональны поверхностной плотности частиц (8), то в первом приближении разумно предполагать, что лизирующая активность дефекта пропорциональна его площади. (А как пропорциональна – надо подумать.) Таким образом, в формуле 5 появляется новый сомножитель, зависящий от поверхностной площади дефекта.

Изучение электрического пробоя бислойных липидных мембран показало, что разрушение мембран наступает при достижении дефектом некоего критического размера (17 – 20). Разумно предположить наличие аналогичных критических размеров и для биомембран. При достижении дефектом критического размера его деструктурирующая активность больше не будет завесить от размера на границе раздела фаз. (Размер дефекта может быть больше или равен размеру вызывающей его частицы.) Вообще говоря, надо учитывать некоторую эффективную площадь мембранного дефекта.

При действии на митохондрии крыс мелиттин (о нём речь будет идти ниже) был в 4 раза активнее грамицидина S. Мелиттин основной литический компонент пчелиного яда. В водных растворах он обнаружен в агрегированном состоянии в виде тетрамеров. На границе раздела фаз, при сжатии и при взаимодействии с фосфолипидом распадается на мономеры. Его комплексы с фосфолипидом могут содержать до 5 молекул последнего. Такие “насыщенные” комплексы обладают площадью в 2,5 раза больше, чем липид-грамицидиновые, но поверхностные давления коллапсов у них были равны. (5) В этих экспериментах поверхностные давления мембран и комплексов “насыщенных” были равны, отличались только площади, приходящиеся на 1 комплекс в монослое. И, быть может, не все комплексы мелиттина с фосфолипидом были “насыщенными”.

Таким образом, полученные результаты указывают, что активным началом является не сам катионный детергент, а его комплекс с молекулами фосфолипида, входящими в состав мембраны. Детергентом уже является пептид-липидный комплекс, который является неионным детергентом. Следовательно, деление детергентов на ионные и неионные не имеет под собой реального основания. При таком деления между собой сравниваются реальное, действующее начало, действующее на структуру мембраны и “полуфабрикат”. Этот “полуфабрикат” становится действующим агентов только после образования комплекса с липидом. При этом, площадь комплекса в мембране больше, чем у исходного “полуфабриката” и, следовательно, его активность выше.

В заключение следует отметить, что, так как существует не обязательно линейная зависимость между мембранной активностью соединения и его площадью на границе раздела фаз, то в заявке и введено требование наличия у молекул одинаковых площадей.

Лизис мембраны – это крайняя стадия действия вещества на мембрану. В малых концентрациях они могут вызывать не лизис, а иные нарушения функционирования мембранных систем. Поэтому, в заявку и включено требование – наблюдать и регистрировать любой вид биологической активности и/или её изменения, вызванные действием мембрано-активных соединений на биологические мембраны.

Ниже приведены значения поверхностного давления ряда биологических мембран, полученные с помощью описанного выше способа (22);

Поверхностное давление цитоплазматических мембран Staphylococcus aureus и Sareina letea равны 55,0 ± 5,0 дин/см;

Поверхностное давление цитоплазматических мембран Bac. subtilis равно 20 – 25 дин/см;

Поверхностное давление цитоплазматических мембран E. coli равно 20 дин/см;

Поверхностное давление цитоплазматических мембран Mycob. phlei. равно 15 – 20 дин/см.

Поверхностное давление мембран бактериородопсиновых бляшек Halobacteriuv halobium равно 34,5 ± 0,5 дин/см.

Метод пригоден не только для мембран прокариотов, но и для эукариотов. Величина латерального поверхностного давления мембран эритроцитов человека равно 34,5 ± 0,5 дин/см, а внешних мембран митохондрий печени крыс – 21,0 ± 0,5 дин/см.

Дополнение № 1.

СКАЧОК ПОВЕРХНОСТНОГО ПОТЕНЦИАЛА монослоёв липид – грамицидинового комплекса, равный 700 ± 20 мВ, в коллапсе меньше, чем у самого грамицидина S на величину скачка потенциала монослоёв фосфатидной кислоты (200 ± 20 мВ), при площадях, занимаемых молекулой фосфолипида близкой к тем, что характерны для различных мембран. (Для плотно упакованных монослоёв.)

Так как вертикальная составляющая дипольного момента липид – пептидного комплекса, примерно, равна разности между дипольными моментами антибиотика и вертикальными составляющими 2-х молекул липида, то наиболее простым объяснением экспериментальных фактов является предположение, что внедрение грамицидина S в монослой и образование комплекса сопровождается переориентацией молекул фосфолипида, связанных с антибиотиком. Видно, что такая переориентация липида возможна при поверхностных давлениях монослоя выше, примерно, 25 дин/см. Очевидно, что при такой структуре липид – пептидного комплекса его поверхностно-активные свойства будут подобны свойствам электронейтрального аналога грамицидина S – N,N’-диацетил грамицидина S.

Дополнение № 2.

В зависимости от знака разности между поверхностным давлением коллапса монослоя деструктурирующего агента и поверхностного давления мембраны могут наблюдаться различные зависимости действия агента от температуры. Если поверхностное давление агента превышает поверхностное давление мембраны, то его биологическое действие, как это следует из полученных уравнений, будет увеличиваться при понижении температуры. Это, вероятно, и наблюдается при действии грамицидина S на мембраны протопластов Micrococcus lysodeikticus (23). В противном случае биологическая активность агента будет падать при повышении температуры. Иными словами, для объяснения температурных зависимостей литического действия детергентов нет необходимости искать какие-то специфические взаимодействия меду деструктурирующим агентом и компонентами биомембран, как это часто делается. А различия в температурных зависимостях действия одного и того же соединения на мембраны различных клеток обусловлены только различиями в поверхностном давлении последних.

Полученные результаты указывают, что возможен целенаправленный подбор поверхностно-активных агентов, действующих на определённые клетки, в том числе и на микроорганизмы. При этом обязательно необходимо учитывать и поверхностное давление мембраны – мишени. От соотношения между указанными выше величинами и зависит эффективность действия лизирующего агента на конкретную клетку при разных температурах.

В заключение данного раздела необходимо отметить, что встраивание инородных частиц в мембрану, взаимодействие которых с липидом слабее взаимодействия липидных молекул между собой, приводит к возникновению структурных дефектов. Следовательно, для появления структурного дефекта необходимо ослабить взаимодействие компонент мембраны между собой в какой-либо её точке. Очевидно, что кроме введения инородных, поверхностно-активных веществ, которые плохо взаимодействуют с мембранными компонентами, существуют и иные пути. Например, модификация отдельных мембранных компонент таким образом, что бы они теряли свои поверхностно-активные свойства и выталкивались с границы раздела фаз за счёт наличия у самой мембраны поверхностно-ак- тивных свойств. Кроме того, возможно, добавляя гидрофильные группы к гидрофобным участкам мембранных белков и/или углеводородным цепям липидов, уменьшить свободную энергию межмолекулярных взаимодействий в гидрофобной области мембраны. При этом может возрастать площадь модифицированной молекулы, что также будет приводить к увеличению её деструктивных свойств. Третий путь, приводящий к ослаблению межмолекулярных взаимодействий в бислойных липидных участках мембран – образование лизолипидов. Т.е. механизм действия лизолипидов заключается в том, что отсутствие углеводородной цепи в молекуле фосфолипида (иначе – уменьшение плотности углеводородных цепей в мембране) приводит к уменьшению межмолекулярных взаимодействий и увеличению подвижности мембранных молекул, составляющих окружение лизолипида, и образованию структурного дефекта.

Таким образом, дан анализ связи литической активности агентов, вызывающих нарушения структуры мембраны, с их свойствами на границе раздела полярной и неполярной фаз. Показана важность знания поверхностного давления биологических мембран – мишени для понимания особенностей действия деструктурирующих агентов. Кратко указаны возможные пути модификации мембранных компонентов, приводящие к нарушению свойств и нормального функционирования биомембран.

• С.Н. Семёнов

Контакт с автором: margys@softel.ru


Другие статьи по теме:
 ХИМИКИ ЛЕЧАТ, ВРАЧИ ХИМИЧАТ
 С развитием пищевой и косметической промышленности значительно увеличилось количество природных и синтетических веществ
 ЗАГАДКИ ВОДЫ
 ВОЗДЕЙСТВИЕ СВЕРХВЫСОКОЭНЕРГЕТИЧНЫХ ЭЛЕКТРОИМПУЛЬСОВ НА МЕТАЛЛОРАСПЛАВЫ
 МАШИНЫ СОЗИДАНИЯ

Добавить комментарий:
Введите ваше имя:

Комментарий:

Защита от спама - введите символы с картинки (регистр имеет значение):

Меняем шины на месте - шиномонтаж 24часа. 24 часа.

Популярные услуги:

  • Ранжирование проектов в России и за рубежом

    Содействие в участии в зарубежных выставыках и конференциях: от подачи завки и подготовки рекламного материала до самого проведения. Подбор кадров для представительств зарубежных компаний и организаций.

    К услуге

  • Продвижение Ваших проектов и помощь бизнесу

    Любые Ваши коммерческие идеи мы превратим в логически законченный, наглядно оформленный документ (бизнес-план), который можно преподнести инвесторам и партнерам..

    К услуге

Подпишитесь на новости:

И на вашу почту всегда будут приходить только самые интересные и отбрные новости нашего проекта.

подписка:

* В данный момент новости возможно получать только по каналу RSS

НАВЕРХ