У Вас есть удачное изобретение?

Публикуйте концепцию и возможно инвестор заметит Вас!

Все живое на Земле, будь то животные или растения, наделено способностью к дыханию. Каков важнейший биологический смысл дыхания? Заключается он прежде всего в обеспечении клеток, из которых состоят организмы, необходимой для жизнедеятельности энергией. Во время дыхания в живых организмах, как в топке, происходит "сгорание" питательных веществ, или, иными словами, окисление их кислородом воздуха. Как и положено при горении, при дыхании выделяется энергия. Рекордсмены по интенсивности дыхания - птицы колибри и летающие насекомые, у которых максимальное потребление кислорода на единицу массы в 30-40 раз превышает аналогичные показатели для человека. И даже при самом эффективном дыхании огромное количество выделяющейся энергии не только не наносит ущерба живому, но и эффективно превращается в биологическую форму. КПД этого процесса у живых организмов составляет около 40% и значительно превосходит КПД обычных тепловых двигателей.

Что же представляют собой столь совершенные механизмы получения энергии в царстве живого? Одним из них является дыхательная цепь. Так называется весь ансамбль белков, переносящих восстановительные эквиваленты (электроны и протоны) на кислород. Какими бы разнообразными ни были питательные вещества, продуктом расщепления большинства из них у аэробных организмов являются НАД×Н или НАДФ×Н. Это и есть те универсальные источники восстановительных эквивалентов, которые дыхательная цепь передает на кислород. У эукариот (животные, растения, грибы) дыхательная цепь расположена в мембранах особых клеточных органелл - митохондриях, у прокариот (бактерии) - в мембранах, непосредственно окружающих клетку.

Каким образом реализуется последовательность реакций в дыхательной цепи? Ясно, что необходимым условием является соответствующая близость ее компонентов. Установлено, что достигается она свободным перемещением и взаимодействием компонентов дыхательной цепи в плоскости мембраны. Таким образом, ансамбль дыхательных белков можно считать цепью только в функциональном, но не в структурном смысле. Все компоненты дыхательных цепей, будь то белки или низкомолекулярные переносчики, характеризуются определенным потенциалом. А так как каждый компонент имеет свой редокс-потенциал, то взаимодействовать он может только с более положительным по потенциалу переносчиком. Расставив их в порядке возрастания потенциала, мы получим настоящую электрическую цепь. Поток электронов, который формируется в процессе дыхания в мембранах, - не что иное, как электрический ток. Разность потенциалов между НАД×Н и кислородом составляет около 1.1 В, а суммарный ток в митохондриях человека достигает 100 А, так что мощность равна 110 Вт.

Редокс-компоненты наиболее изученной дыхательной цепи митохондрий распадаются на четыре эквипотенциальные группы. Перепада потенциалов между ними достаточно для того, чтобы энергия, выделяющаяся во время передачи электронов, трансформировалась в универсальную биологическую форму. Согласно хемиосмотической теории сопряжения, автором которой является всемирно известный биоэнергетик П. Митчелл, такой формой энергии является трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода () [1]. Создается она компонентами дыхательной цепи, которые можно рассматривать как протонные насосы. При этом важная роль принадлежит мембране - она заряжается подобно конденсатору. А в зависимости от того, через какой белковый комплекс в мембране происходит разрядка, клеткой могут совершаться различные виды работы: синтез АТФ, движение бактерий, транспорт веществ в клетку и из клетки и т.д. [2]. В последние два десятилетия справедливость хемиосмотической теории была убедительно доказана как в нашей стране, так и за рубежом.

Особого внимания заслуживает конечный участок дыхательной цепи, завершающий перенос электронов на О2 с образованием воды. Он характеризуется самым большим перепадом потенциала - до 0.57 В. Столь большое значение этой величины позволяет высвобождающейся энергии не только трансформироваться в биологическую форму, но и обеспечить необратимость дыхания на конечном участке. В роли молекулярного трансформатора энергии в процессе восстановления кислорода до воды выступает комплекс мембранных белков, называемый терминальными оксидазами, которые принадлежат к наиболее обширному классу ферментов оксидоредуктаз. Эти ферменты катализируют реакции между двумя субстратами, из которых один (донор) восстанавливает, а другой (акцептор) окисляет. Ясно, что в случае терминальных оксидаз акцептором служит кислород. Среди оксидаз, изученных к настоящему времени, способность к энергетическому сопряжению обнаружена только у гемсодержащих белковых комплексов. Это означает, что необходимым компонентом этих ферментов являются гемы - железопорфириновые комплексы, в которых ионы хелатируемого железа способны к обратимому окислению (или восстановлению).

Терминальные оксидазы эукариот удивительно однообразны: все они содержат по два гема типа А (оксидазы аа3-типа), а донором электронов для них служит цитохром с. В отличие от эукариот прокариоты располагают большим разнообразием этих ферментов. В составе бактериальных оксидаз встречаются все известные типы гемов: A, B, C, D и O (рис.1), да еще и не по одному, а в наборах по два-три типа в одном ферменте. Более того, дыхательная цепь прокариот завершается, как правило, не одной, а сразу несколькими оксидазами разного типа (рис.2). Донором электронов для одних служит цитохром с - они называются цитохром-с-оксидазами. Те же ферменты, которые используют хинол в качестве донора, называются хинолоксидазами. Функциональное значение множественности и разнообразия оксидаз бактерий - предмет оживленных дискуссий.

В лаборатории академика В. П. Скулачева было обнаружено, что терминальный участок дыхательной цепи алкало- и галотолерантной бактерии Bacillus FTU, кроме "митчелловского" протона, выбрасывает ионы Na+. Способность запасать энергию в виде градиента Na+ на мембране известна у многих морских щелочелюбивых бактерий. Классический объект биологических исследований кишечная палочка Escherichia coli не принадлежит к этому типу бактерий, поэтому в привычных для нее условиях действует "протонная" энергетика. Но если Н+-градиент падает на мембранах этой бактерии (например, при росте в присутствии дыхательных ядов или веществ-разобщителей, снижающих ), то и она способна переключаться на другой тип энергетики - натриевый. Причем выброс Na+ на терминальном участке дыхательной цепи E.coli был зафиксирован только у мутантных и диких штаммов, содержащих оксидазу bd-типа [3]. Известно, что в запасании энергии у E.coli участвуют по крайней мере две хинолоксидазы, bo- и bd-типа, причем свойство протонного насоса присуще только оксидазе bo-типа. Здесь нужно провести черту, от которой и началась наша работа.

Bacillus FTU содержит оксидазы двух типов: цитохромоксидазу caa3 и спектрально напоминающую оксидазу bo-типа E.coli (в начале работы ее назвали o- подобной оксидазой). Оксидаза caa3-типа оказалась на порядок более чувствительной к дыхательному яду - цианиду калия, чем оксидаза bo-типа. Эффективность подавления цианидом выброса Н+ и Na+ из клеток, изученная до начала нашей работы, удивительным образом совпала с обнаруженным нами действием этого яда как на активность оксидазы caa3-типа, так и o-подобной. Этот факт мог указывать на связь выброса Н+ с работой оксидазы caa3-типа, а Na+ - с o- подобной оксидазой.

Результаты экспериментов позволили нам разделить изучаемые оксидазы на две группы: более чувствительные к цианиду оксидазы caa3-типа Bacillus FTU и bo-типа E.coli, преобладающие в средней (экспоненциальной) фазе роста клеток, и менее чувствительные к цианиду оксидазы - o-подобная Bacillus FTU и bd-типа E.coli, преобладающие в конечной (стационарной) фазе. Поскольку жизнедеятельность бактерий тесно связана с уровнем растворенного кислорода в среде роста, можно полагать, что оксидазы, индуцирующиеся в середине и в конце ростового цикла соответственно, имеют различное сродство к кислороду. Для удобства в эксперименте мы использовали не сам кислород, а угарный газ (СО). Известно, что сродство молекулы СО к активному центру оксидаз слабее, чем у молекулы О2. Это позволяет следить за кинетикой связывания CO с ферментом в реальной временной шкале по характерным полосам в спектре оптического поглощения оксидаз. Дело в том, что все гемсодержащие белки легко распознаются по спектру поглощения света, что обусловлено присутствием гема. В спектре поглощения таких белков в восстановленном состоянии есть три полосы: a, b и g. По положению a-полосы можно определить тип связанного с белком гема. В присутствии CO полосы поглощения гемсодержащих оксидаз изменяются.

Мы воспользовались сведениями, известными со времен исследований О. Варбурга и Д. Кейлина [4, 5] о том, что под действием света комплексы оксидаз и СО способны обратимо разлагаться и, соответственно, обратимо изменять спектр оптического поглощения. Техника слежения за спектральными изменениями, происходящими после облучения СО- комплексов оксидаз лазером, была разработана Б. Чансом и Л. Кастором [6, 7]. Метод позволил им открыть в микроорганизмах оксидазы o- типа. В отсутствие CO положение a-полосы в спектрах поглощения оксидаз o-типа обычно совпадает с положением a-полосы цитохромов b- типа, поэтому до разработок Чанса и Кастора исследователи не могли обнаружить оксидазы o-типа. Единственный факт, что в a-полосах спектров поглощения бактерий в присутствии CO происходит изменение оптического поглощения при облучении светом, и дал основание сделать заключение о присутствии оксидаз нового, o-типа, так как обычные цитохромы b не связывают СО и, следовательно, не могут давать изменения оптического поглощения. Однако кинетические характеристики процесса, происходящего при облучении лазером СО-комплексов оксидаз, не исследовались.

Мы разработали и впервые применили методику анализа с помощью ЭВМ кинетических процессов, происходящих при импульсном облучении комплексов СО и шести различных оксидаз из трех бактерий: Bacillus FTU, E.coli и Methylobacillus flagellatum KT. Установка для регистрации оптических процессов при наносекундном лазерном возбуждении с непосредственным вводом сигналов в ЭВМ была разработана и изготовлена доктором биологических наук Л. А. Драчевым [8].

Первые шаги на пути сравнительного исследования привели нас к неожиданному результату. При реассоциации с СО оксидаза bo- типа E.coli обнаруживала полное совпадение не с o- подобной оксидазой Bacillus FTU, как это можно было бы предполагать, а с оксидазой caa3-типа Bacillus FTU. Кинетика процесса оказалась монофазной с характерным временем t=25-30 мс (рис.3, а,б). К еще большему нашему удивлению, o-подобная оксидаза Bacillus FTU по кинетике реассоциации с СО обнаружила сходство с оксидазой bd-типа E.coli. В случае этой пары оксидаз кинетика была трехфазной с t1=35-70 мкс, t2=250-500 мкс, t3=2-5 мс (рис.3, в,г). Благодаря этим результатам выяснилось, что причина сходства и различия оксидаз, видимо, таилась не в природе гемовых групп, а в строении белковых молекул. Совместно с сотрудником кафедры биоорганической химии МГУ В.А. Гринкевичем мы расшифровали N- концевые фрагменты субъединиц оксидазы caa3- типа Bacillus FTU. Стало очевидно, что сходство с оксидазой bo-типа E.coli не случайно. Ферменты принадлежали к одному большому семейству Н+-переносящих оксидаз, в которое входят и терминальные оксидазы высших организмов.

В это же самое время мы вместе с сотрудниками кафедры микробиологии МГУ А.И.Нетрусовым и Т.Ю.Динариевой занимались изучением терминальных оксидаз только что выделенной бактерии-метилотрофа (Methylobacillus flagellatum KT). У этой бактерии по физиологическим тестам и по чувствительности к цианиду нам удалось обнаружить присутствие двух спектрально неразличимых оксидаз o-типа. Дальнейшая работа с этими ферментами оказалась бы крайне затрудненной, если бы не наш лазерный метод. Разделить и очистить оксидазы биохимическими методами не представлялось возможным, так как критерии принадлежности фермента к одной или другой оксидазе практически отсутствовали, если не считать различную чуствительность ферментов к цианиду. Поэтому для работы пришлось использовать препараты мембран, которые дали сложную картину. Анализ на ЭВМ кинетической кривой, полученной при реассоциации СО и мембран, показал, что она четырехфазна (см. рис.3, д). Самая медленная компонента совпадала по t и по спектру амплитуд оптических изменений с оксидазой bo-типа E.coli. Интересно, что три другие, более быстрые компоненты по t и спектру, ничем не отличались от таковых для o-подобной оксидазы Bacillus FTU. Картина сходства оксидаз была бы неполной, если не отметить, что большая чувствительность к цианиду и преобладание в экспоненциальной фазе роста бактерии оказались характерными для оксидазы, сходной с оксидазой bo-типа E.coli. Полученные на этом этапе данные представлены в таблице.

При осмыслении этих данных возникает закономерный вопрос: чем на уровне структуры отличаются оксидазы o-типа и o- подобные? Такой вопрос появлялся у многих исследователей [9-11], но до настоящего времени ответа на него в научной литературе не было. Начиная от первых исследований Чанса и Кастора и до 1991 г. на основании близкого сходства спектральных характеристик оксидазы o-типа и цитохромов b считалось, что указанные оксидазы содержат в своем составе гемы B. В 1991 г. А. Пуустинен и М. Викстрем [12] показали, что оксидаза bo-типа E.coli, кроме гемов B, содержит гемы неизвестной структуры. Подобно гему А, новое соединение имело в качестве заместителей гидроксильную и фарнезильную группы, а в положении 8 - метильную группу, подобно гему В (см. рис.1). Открытое соединение было названо гемом О. С его открытием стала понятной наблюдаемая гомология между оксидазами aa3-, caa3- и bo-типа. Эти оксидазы содержат родственные гемы А и О и являются представителями протонной энергетики. Теперь стало очевидным, что причины сходства оксидаз кроются в структуре не только белковой молекулы, но и гемов. Однако вопрос о соотношении o-подобных оксидаз и оксидаз o- типа оставался по-прежнему открытым.

Для поиска ответа на этот вопрос решено было исследовать простетические группы ферментов. У хорошо изученных терминальных оксидаз эукариот они представлены гемами и ионами меди. Изменение степени окисленности и восстановленности ионов железа, входящих в гемовые структуры, и ионов меди - основной элемент катализа. При сравнительном изучении гемового состава исследуемых оксидаз мы обнаружили, что мембранные препараты, полученные из клеток Bacillus FTU, не содержат гемов О и D, подобных тем, которые есть в оксидазах bo- и bd-типа E.coli. В мембранах присутствовали гемы А, В и С. В состав же очищенной оксидазы caa3-типа, как и следовало ожидать, входили гемы А и С. Однако o-подобная оксидаза Bacillus FTU содержала не гемы О, а только гемы В, структурно более близкие гему D (см. рис.1). Этот на первый взгляд неожиданный результат позволяет понять столь резкое различие в свойствах оксидазы bo-типа E.coli и спектрально похожей на нее o-подобной оксидазы Bacillus FTU. Оставался нерешенным еще один вопрос: в чем заключается причина сходства o-подобной оксидазы Bacillus FTU и оксидазы bd-типа E.coli?

Известно, что оксидаза bd-типа, кроме того, что не участвует в транспорте Н+, не содержит ионов меди [13]. Этот факт побудил нас провести исследование содержания ионов меди в образцах оксидаз. Было обнаружено, что оксидаза caa3-типа Bacillus FTU, подобно оксидазам высших организмов и оксидазе bo-типа E.coli, содержит ионы меди. Как и оксидаза bd-типа E.coli o-подобная оксидаза Bacillus FTU не содержала меди. На основании изложенных результатов мы предложили o-подобную оксидазу Bacillus FTU отнести к оксидазам нового bb-типа, по свойствам имеющим большое сходство с оксидазой bd-типа E.coli.

Итак, выделяемые нами первоначально по физиологическому принципу две группы терминальных оксидаз бактерий, представляют собой два семейства со сходными структурно-функциональными свойствами. Одно из них включает оксидазы - протонные генераторы энергии в биомембранах, другое объединяет оксидазы непротонного типа. Для первого характерно наличие в структуре гемов, содержащих фарнезильные заместители (т. е. гемы А- или О-типов), и ионов меди. Они более чувствительны к цианиду калия, чем оксидазы непротонного типа, преобладают на начальных стадиях роста бактериальных культур и характеризуются медленной реассоциацией с СО. В составе молекул оксидаз непротонного типа отсутствуют ионы меди, а содержащиеся гемы (B- и D-типов) не имеют фарнезильных заместителей. Эти оксидазы более устойчивы к цианиду по сравнению с протонными оксидазами, они преобладают в конце ростового цикла бактериальных культур и с высокой скоростью рекомбинируют с СО.

Способность оксидазы caa3-типа Bacillus FTU к трансмембранному переносу Н+ установлена нами как прямым методом на реконструированных протеолипосомах, так и косвенно - ингибиторным анализом и определением гомологии аминокислотной последовательности белковой молекулы с другими Н+-переносящими оксидазами. Для оксидазы bb- типа отсутствие способности к трансмембранному переносу Н+ установлено ингибиторным анализом и прямым методом на целых клетках.

Обнаружение двух семейств бактериальных оксидаз с различными типами энергетики позволяет понять природу устойчивости бактерий к некоторым ядовитым веществам, найти пути борьбы с болезнетворными и вредоносными бактериями. Понимание принципов преобразования энергии химических соединений в биологическую форму белками - молекулярными генераторами электрического тока - важно для управления биосинтезами в искусственных полиферментных системах. А налаженный в ходе исследования метод импульсной спектроскопии в настоящее время незаменим при индикации и идентификации бактериальных оксидаз.

Автор: М. С. Мунтян, Д. А. Блох, В. С. Устиян

Введите ваше имя:

Комментарий:

Защита от спама - введите символы с картинки (регистр имеет значение):